|
|
Vývoj rychlé metody cílené mutageneze bakterie Streptococcus zooepidemicus
Černý, Zbyněk ; Španová, Alena (oponent) ; Pepeliaev,, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřena na vyvinutí rychlé metody cílené mutageneze genů Streptococcus zooepidemicus založené na přirozené kompetenci buněk. Na základě experimentálních dat byly vybrány geny pro deleci, které s vysokou pravděpodobností mají vliv na syntézu kyseliny hyaluronové. Byla provedena delece vybraných genů z genomové DNA jako důkaz účinnosti metody, a u rekombinantních kmenů S. zooepidemicus byly sledovány změny koncentrace prekurzorů kyseliny hyaluronové (glukuronová kyselina a N-acetylglukózamin) v čase a výsledná produkce kyseliny hyaluronové.
|
|
|
Factors interacting with bacterial RNA polymerase and their effect on the regulation of transcription initiation
Ramaniuk, Volha ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
(ČESKÝ) Bakteriální buňka reguluje svou genovou expresi jako odpověď na změny růstových podmínek. RNA polymeráza (RNAP) je stěžejním enzymem pro tento proces, její aktivita je ovlivňována mnoha transkripčními faktory. Ve své práci se zabývám faktory, které se účastní regulace transkripce u grampozitivních baktérií: faktory σ, iniciačními nukleozid trifosfáty (iNTP), HelD, δ a malou RNA Ms1. Hlavní důraz v této práci je kladen na faktory σ z Bacillus subtilis. Faktory σ rozpoznávají specifickou sekvenci DNA promotoru a umožnují navázaní RNAP na tuto sekvenci. Ve svém prvním projektu jsem vytvořila transkripční systém in vitro s purifikovanými alternativními σ faktory z B. subtilis - σB , σD , σH , σI . Pomocí tohoto systému jsem zkoumala efekt změny koncentrace iNTP ([iNTP]) na iniciaci transkripce. Prokázala jsem, že promotory přepisované pomocí alternativních σ faktorů jsou často regulovány [iNTP]. V dalším projektu jsem charakterizovala jeden z nejméně prozkoumaných alternativních faktorů z B. subtilis, I . Identifikovala jsem ~130 genů ovlivněných I , přitom 16 z nich bylo přepisováno přímoI . Prokázala jsem, že se I účastní metabolizmu železa v buňce, a že se váže nejenom na klasické sekvence -35 a -10, ale také na "prodloužené" -35 a -10 elementy. Ve spolupráci s bioinformatickou...
|
|
|
Regulation of transcription in mycobacteria.
Páleníková, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Mrvová, Silvia (oponent)
Bakteriálna bunka sa musí vedieť rýchlo prispôsobiť zmenám, ktorým je vystavená v prostredí. Na tieto zmeny reaguje reguláciou génovej expresie primárne na úrovni iniciácie transkripcie. Medzi formy reguláciu transkripcie môžeme zaradiť rôznu stavbu promótorových oblastí pred odlišnými skupinami génov, prítomnosť alternatívnych sigma faktorov a tiež ovplyvňovanie priebehu génovej expresie pôsobením transkripčných faktorov buď ako aktivátory, alebo ako inhibítory. V tejto práci sú popísané spôsoby regulácie transkripcie u baktérií rodu Mycobacterium, ku ktorým zahrňujeme aj patogénne baktérie M. tuberculosis a M. leprae. Baktérie tohto rodu vykazujú malú konzervovanosť promótorových oblastí, veľké množstvo sigma faktorov, veľký počet transkripčných faktorov, prítomnosť dvojkomponentových systémov a mnoho, zatiaľ málo preskúmaných, malých regulačných RNA.
|
|
|
Účast alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při regulaci exprese genů Corynebacterium glutamicum
Šilar, Radoslav ; Nešvera, Jan (vedoucí práce) ; Branny, Pavel (oponent) ; Lichá, Irena (oponent)
Abstrakt Regulace transkripce sigma faktory RNA polymerasy s extracytoplazmatickou funkcí (ECF) představuje velmi účinný nástroj pro adaptaci buňky na stresové podmínky vyvolané změnami ve vnějším prostředí. Gram-pozitivní, aerobní bakterie Corynebacterium glutamicum je významným producentem aminokyselin. V genomu C. glutamicum se nachází 7 genů kódujících sigma faktory: primární sigma faktor SigA, sigma faktor SigB označovaný jako primary-like sigma faktor a 5 ECF sigma faktorů (SigC, SigD, SigE, SigH a SigM). Gen sigH, kódující sigma faktor SigH se nachází v těsné blízkosti genu rshA kódujícího jeho anti-sigma faktor. Anti-sigma faktory se reverzibilně vážou k příslušným sigma faktorům, čímž blokují jejich aktivitu. Za stresových podmínek je vazba mezi oběma proteiny rozrušena a uvolněný sigma faktor se může vázat k jádru RNA polymerasy a aktivovat iniciaci transkripce. V práci byla studována především regulace exprese genů kódujících nejvýznamnější ECF sigma faktor SigH a jeho anti-sigma faktor RshA a geny patřící k jeho regulonu. Transkripční analýzou operonu sigH-rshA byly identifikovány čtyři vegetativní promotory genu sigH a jeden SigH-dependentní promotor genu rshA. Účast komplexu SigH-RshA na regulaci exprese genů byla zkoumána s použitím delečního kmene C. glutamicum ΔrshA. Metodou DNA...
|
|
|
The effect of 6S-like RNAs on physiological differentiation of Streptomyces coelicolor
Burýšková, Barbora ; Bobek, Jan (vedoucí práce) ; Branny, Pavel (oponent)
Rozmanitost bakterií a jejich genomů může zapříčinit konzervaci funkčních molekulárních motivů na úrovni strukturní místo konzervace na úrovni sekvencí. V případě regulační 6S RNA byly nalezeny sekvenční homology u více než sta bakteriálních druhů. U bakterií rodu Strepomyces však nebyl nalezen žádný. Jedinečný genom těchto bakterií, důležitých pro svou schopnost produkce antibiotik, má vysoký obsah G-C párů bází a je představitelem unikátních genomů fylogeneticky staré větve Aktinobakterií. Funkce nekódující 6S RNA je dána její sekundární strukturou. 6S RNA svou strukturou napodobují cílové promotorové sekvence a vychytávají tak sigma faktory, které jsou součástí transkripčního aparátu. Tímto napomáhají přepínání souborů exprimovaných genů během vývojových přechodů. Pomocí porovnání in silico predikovaných sekundárních struktur známých 6S RNA byl vytvořen počítačový model, který predikoval 6S-like RNA u Streptomycet. Cílem této práce bylo ověřit expresi těchto 6S-like RNA predikovaných u Streptomyces coelicolor pomocí RT-PCR a RNA koimunoprecipitace (RNA CoIP). Výsledkem této práce je detekce šesti nových ncRNA transkriptů, které by mohly být homology 6S RNA u Streptomycet. Tato zjištění rovněz potvrdila in silico predikční metodu, kterou byly nalezeny nekóducíjí bakteriální RNA na základě...
|
|
|
Factors interacting with bacterial RNA polymerase and their effect on the regulation of transcription initiation
Ramaniuk, Volha
(ČESKÝ) Bakteriální buňka reguluje svou genovou expresi jako odpověď na změny růstových podmínek. RNA polymeráza (RNAP) je stěžejním enzymem pro tento proces, její aktivita je ovlivňována mnoha transkripčními faktory. Ve své práci se zabývám faktory, které se účastní regulace transkripce u grampozitivních baktérií: faktory σ, iniciačními nukleozid trifosfáty (iNTP), HelD, δ a malou RNA Ms1. Hlavní důraz v této práci je kladen na faktory σ z Bacillus subtilis. Faktory σ rozpoznávají specifickou sekvenci DNA promotoru a umožnují navázaní RNAP na tuto sekvenci. Ve svém prvním projektu jsem vytvořila transkripční systém in vitro s purifikovanými alternativními σ faktory z B. subtilis - σB , σD , σH , σI . Pomocí tohoto systému jsem zkoumala efekt změny koncentrace iNTP ([iNTP]) na iniciaci transkripce. Prokázala jsem, že promotory přepisované pomocí alternativních σ faktorů jsou často regulovány [iNTP]. V dalším projektu jsem charakterizovala jeden z nejméně prozkoumaných alternativních faktorů z B. subtilis, I . Identifikovala jsem ~130 genů ovlivněných I , přitom 16 z nich bylo přepisováno přímoI . Prokázala jsem, že se I účastní metabolizmu železa v buňce, a že se váže nejenom na klasické sekvence -35 a -10, ale také na "prodloužené" -35 a -10 elementy. Ve spolupráci s bioinformatickou...
|
|
|
Účast alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při regulaci exprese genů Corynebacterium glutamicum
Šilar, Radoslav
Abstrakt Regulace transkripce sigma faktory RNA polymerasy s extracytoplazmatickou funkcí (ECF) představuje velmi účinný nástroj pro adaptaci buňky na stresové podmínky vyvolané změnami ve vnějším prostředí. Gram-pozitivní, aerobní bakterie Corynebacterium glutamicum je významným producentem aminokyselin. V genomu C. glutamicum se nachází 7 genů kódujících sigma faktory: primární sigma faktor SigA, sigma faktor SigB označovaný jako primary-like sigma faktor a 5 ECF sigma faktorů (SigC, SigD, SigE, SigH a SigM). Gen sigH, kódující sigma faktor SigH se nachází v těsné blízkosti genu rshA kódujícího jeho anti-sigma faktor. Anti-sigma faktory se reverzibilně vážou k příslušným sigma faktorům, čímž blokují jejich aktivitu. Za stresových podmínek je vazba mezi oběma proteiny rozrušena a uvolněný sigma faktor se může vázat k jádru RNA polymerasy a aktivovat iniciaci transkripce. V práci byla studována především regulace exprese genů kódujících nejvýznamnější ECF sigma faktor SigH a jeho anti-sigma faktor RshA a geny patřící k jeho regulonu. Transkripční analýzou operonu sigH-rshA byly identifikovány čtyři vegetativní promotory genu sigH a jeden SigH-dependentní promotor genu rshA. Účast komplexu SigH-RshA na regulaci exprese genů byla zkoumána s použitím delečního kmene C. glutamicum ΔrshA. Metodou DNA...
|
|
|
Analysis and mapping of binding sites of gene expression regulators in the genus of Streptomyces.
Šmídová, Klára ; Bobek, Jan (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Kopecký, Jan (oponent)
Streptomycety jsou lékařsky důležité bakterie žijící v půdě, které podléhají morfologickým změnám od spór po vzdušné hyfy a jsou důležitými producenti bioaktivních látek včetně antibiotik. Jejich genová exprese je přísně regulována v časných úrovních transkripce a translace. Během řízení transkripce hrají sigma faktory ústřední roli; modelový organismus Streptomyces coelicolor má ohromujících 65 sigma faktorů. Exprese sigma faktorů samotných je řízena na post-transkripční úrovni působením malých RNA molekul, které modifikují hladinu jejich messengerových RNA. Avšak pouze několik sigma faktorů ve streptomycetách má známé regulony a také jejich regulace prostřednictvím malých RNA molekul nebyla dosud studována. V závislosti na předtím naměřených datech o genové expresi jsme vybrali několik vysoce exprimovaných sigma faktorů. Pomocí mutantních kmenů nesoucích sigma faktory značené HA tagem byly analyzovány regulony dvou důležitých sigma faktorů, SigQ a HrdB, pomocí techniky ChIP-seq. Další sigma faktory byly dále studovány pomocí metody 5 ' a 3' RACE a Northern blottingu, aby se zjistilo, zda mají asRNA. Naše data potvrzují nezbytnost sigma faktoru HrdB během vegetativní fáze růstu. Ukázalo se, že druhý sigma faktor, SigQ, je důležitým regulátorem metabolismu dusíku a regulátorem reakce na osmotický...
|
|
|
Stresové odpovědi kmenů rodu Rhodococcus
Křenková, Lucie ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Cajthaml, Tomáš (oponent)
Bakterie si během evoluce vyvinuly důmyslné mechanismy, které jim umožňují přežívat a růst v nehostinných podmínkách s extrémními hodnotami teploty, vodní a osmotické aktivity a pH. Bakterie rodu Rhodococcus jsou ve schopnosti přizpůsobit se takovýmto extrémům natolik efektivní, že jsou schopny růst i v přítomnosti toxických sloučenin, čímž mezi bakteriemi vynikají. Jejich velký genom ukrývá velké množství genů využitelných v široké škále katabolických drah. Využitelnost v biotechnologiích je podmíněna znalostí mechanismů stresových odpovědí. Kmeny rhodokoků na stresové podmínky reagují změnou exprese genů pomocí transkripčních regulátorů, dvousložkových systémů a sigma faktorů RNA polymerázy. Základním modelem odpovědi na stresové podmínky je zvýšení exprese chaperonů, chaperoninů a proteáz, které opravují či degradují poškozené proteiny. Většina stresových odpovědí je velmi komplexních a překrývají se také skupiny genů, které na ně reagují. Interpretace výsledků studií na toto téma je tedy velmi náročný, avšak pro optimalizaci využití v biotechnologiích naprosto nezbytný proces. Klíčová slova: stresové odpovědi, bakterie, Rhodococcus, biotechnologie, degradace, toxické sloučeniny, sigma faktor
|
|
|
Funkce stresových sigma faktorů RNA polymerasy SigD, SigE, SigH a SigM v transkripční regulační síti Corynebacterium glutamicum
Dostálová, Hana ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Bobek, Jan (oponent) ; Halgašová, Nora (oponent)
Grampozitivní bakterie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 je významným průmyslovým producentem aminokyselin a dalších metabolitů. Její genom kóduje 7 podjednotek sigma (σ) RNA polymerázy: primární faktor σA , primárnímu faktoru podobný σB a pět alternativních faktorů sigma, σC , σD , σE , σH a σM (faktory s extracytoplazmatickou funkcí). Tato práce se zaměřila na odhalení dosud neznámých regulonů stresových faktorů sigma nebo upřesnění popisu regulonů, jejichž geny jsou řízeny faktory σD , σE , σH a σM , které byly zčásti popsány pro svou aktivitu při odpovědích na povrchový (σD a σE ), tepelný (σE , σH a σM ) a oxidativní stres (σH a σM ). Vycházeli jsme z toho, že geny každého regulonu jsou přepisovány z jedné třídy promotorů. Pro účely detailní analýzy promotorů bylo třeba vyvinout metody, které rychle a spolehlivě přiřadí faktor sigma k jednotlivým promotorům, a tedy i genům. K tomuto účelu byla vyvinuta kombinace metod in vivo (dvouplazmidový systém) a in vitro (in vitro transkripce) umožňující zpřesnit toto přiřazení. Těmito metodami jsme identifikovali 9 σH /σE -promiskuitních promotorů (PamtR, Pcg0378, Pcg1121, Pcg3309, Pcg3344, PclgR, PdnaJ, PdnaK a PsigB), 7 σD /σH -promiskuitních promotorů (Pcg0607, Pcg2047, Pcmt2, PfadD2, Plpd, PlppS a PrsdA) a 9 σH /σM -promiskuitních promotorů...
|
host ::
RSS.